Proposal Skripsi Kultur Invitro Jarak Pagar

Judul   : Proliferasi Kalus dan Embriogenesis Somatik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) dengan Berbagai Kombinasi ZPT dan Asam Amino.






I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Jarak pagar (Jatropha curcas Linn.) merupakan anggota dari famili Euphorbiaceae yang merupakan tanaman perdu serbaguna, dimana hampir semua bagian dari tanaman ini dapat dimanfaatkan oleh masyarakat untuk memenuhi kebutuhannya. Tanaman ini berasal dari Amerika Tengah dan telah menyebar sampai ke Afrika dan Asia. Penyebarannya hampir di seluruh wilayah Indonesia (Thepsamran, 2007).
Jarak pagar dipandang menarik sebagai sumber biodiesel karena kandungan minyak bijinya yang tinggi yang dapat mencapai 63%, melebihi kandungan minyak biji kedelai (18%), bunga matahari (40%), atau inti sawit (45%). Minyaknya didominasi oleh asam oleat (44,7%), dan asam linoleat (32,8%) sementara asam palmitat (14,2%) dan asam stearat (7%) adalah tipe asam lemak jenuhnya. Disamping itu penggunaannya tidak berkompetisi untuk pemanfaatan lain. Sebagai biodiesel, minyak jarak pagar perlu diproses dengan metilasi terlebih dahulu, sebagaimana minyak nabati lain. Produk sampingan dari proses trans-esterifikasi (metilasi) dapat diperdagangkan sebagai bahan baku industri yang memanfaatkan asam lemak, seperti kertas berkualitas tinggi (high quality paper), sabun, kosmetik, obat batuk, dan agen pelembab pada tembakau (Akbar et al., 2009).
Menurut data ESDM (2006) cadangan minyak Indonesia hanya tersisa sekitar 9 milliar barel. Apabila terus dikonsumsi tanpa ditemukannya cadangan minyak baru, diperkirakan cadangan minyak ini akan habis dalam dua dekade mendatang. Bila hal ini terus berlanjut tanpa mempertimbangkan energi alternatif maka akan terjadi permasalahan yang krusial bagi ekonomi bangsa Indonesia.
Permasalahan utama yang dialami dalam pengembangan tanaman jarak pagar ini adalah belum tersedianya bibit unggul yang mampu menghasilkan produksi minyak jarak yang tinggi dikarenakan mutu bibit yang digunakan masih belum memuaskan. Dalam upaya untuk mendapatkan jarak pagar varietas unggul dapat dilakukan melalui perakitan varietas unggul baru. Salah satu faktor penting dalam merakit varietas unggul baru adalah adanya peningkatan keragaman genetik dari jarak pagar yang diberi perlakuan tertentu.
Salah satu teknologi pilihan yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman adalah dengan menggunakan teknologi kultur in vitro. Regenerasi tanaman dengan menggunakan teknik kultur jaringan ini dapat dilakukan melalui jalur organogenesis (melalui pembentukan organ langsung dari eksplan) dan embriogenesis somatik (melalui pembentukan embrio somatik). Perbanyakan tanaman dengan menggunakan teknik kultur jaringan melalui jalur embriogenesis somatik lebih menguntungkan dibandingkan melalui organogenesis karena dapat menghasilkan tanaman baru dengan jumlah yang lebih banyak. Selain itu, karena embrio somatik berasal dari sel tunggal maka akan lebih mudah untuk memonitor proses pertumbuhan setiap individu tanaman (Jimenez, 2001).
Embriogenesis somatik merupakan suatu proses dimana sel – sel somatik (baik haploid maupun diploid) berkembang membentuk tumbuhan baru melalui tahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet (Williams dan Maheswara, 1986). Perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan melalui embriogenesis somatik dapat berhasil apabila diperoleh presentase kalus embriogenik yang cukup tinggi dari eksplan yang dikulturkan ke dalam media tertentu. Proses embriogenesis dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain adalah genotip tanaman, sumber eksplan, komposisi media, zat pengatur tumbuh dan keadaan fisiologi sel (Terzi dan Loschiavo, 1990 ; Ehsanpour, 2002).
Kecepatan proses embriogenesis somatik dipengaruhi oleh dua faktor pembatas yaitu inisiasi embrio somatik dan regenerasi tanaman. Keduanya membutuhkan kondisi yang tepat termasuk komposisi media dan zat pengatur tumbuh.
Masalah utama dalam penggunaan zat pengatur tumbuh adalah ketepatan memilih jenis dan konsentrasi yang sesuai dengan jenis tanaman dan kondisi fisiologis dari eksplan atau jaringan yang ditumbuhkan. Hal ini dikarenakan setiap jenis dan jaringan tanaman mempunyai respon tersendiri terhadap pemberian zat pengatur tumbuh. Disamping itu, kandungan hormon pada tanaman juga harus diperhatikan. Zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan nutrisi yang dalam konsentrasi rendah (< 1mM) dapat mendorong, menghambat atau secara kualitatif mengubah pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Wiendi et al., 1992). Dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin.
Secara umum diketahui bahwa auksin dalam konsentrasi tinggi mendorong embrio somatik secara efektif. Pada umumnya pemberian auksin kedalam medium padat tanpa sitokinin dapat menginduksi kalus embriogenik, tetapi dengan penambahan sitokinin akan meningkatkan proliferasi kalus embriogenik. Hasil pada embriogenesis somatik langsung telah menunjukan bahwa BAP sangat penting untuk menginduksi embriogenesis somatik dari kotiledon eksplan J. curcas. Embrio somatik adalah embrio yang berasal dari sel – sel  somatik (tidak merupakan hasil peleburan gamet jantan dan gamet betina).
Asam - asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Penambahan kasein hidrolisat kedalam media yang sudah mengandung 2,4-D dapat memacu pembentukan kalus yang embriogenik karena kasein hidrolisat merupakan sumber N di dalam media. Selain kasein hidolisat pemberian asam amino glutamin atau narginin pada media yang sudah mengandung auksin dapat pula meningkatkan keberhasilan pembentukan kalus embriogenik karena di dalam kloroplas, asam amino dapat berperan sebagai prekursor untuk pembentukan asam nukleat dan proses seluler lainnya (Gunawan, 1988).
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Vesco dan Guerra (2001) pada tanaman Feijoa sellowiana menunjukan bahwa penggunaan NO3- (49mM) sebagai sumber N tunggal menghasilkan jumlah embrio somatik yang rendah, tetapi ketika ke dalam media ditambahkan glutamin (4mM) maka jumlah embrio somatik meningkat hingga 5,8 kali setelah 10 minggu.
Purmaningsih (2003) melakukan penelitian pada 4 varietas padi, penggunaan formulasi media MS + 2,4-D 2 mgL- + CH 3000 mgL-, MS + 2,4-D 0,5 mgL- +BA 0,5 mgL- dan MS + 2,4-D 20 mgL- menghasilkan kalus yang remah (friable), globular (terbentuk nodul – nodul), dan berwarna bening. Sedangkan formulasi media MS + picloram 10 mgL- + thidiazuron 0,4 mgL- paling rendah dalam menginduksi pembentukan kalus, selain itu kalus yang dihasilkan bersifat kompak.
Sukmadjaja (2003) melakukan penelitian pada tanaman cendana, presentase pembentukan embrio somatik dari eksplan embrio zigotik muda pada media MS + BAP 2 mgL- menunjukan nilai tertinggi (71,4%), sedangkan untuk eksplan embrio zigotik dewasa, nilai tertinggi (63,6%) diperoleh pada media MS + BAP 1 mgL-.
Selanjutnya Sumaryono dan Riyadi (2005) melakukan penelitian pada eksplan kina klon CB5 dan mendapatkan hasil proliferasi kalus terbaik dengan bobot basah yang meningkat 12-14 kali dari bobot awal dalam waktu 6 minggu yang diperoleh pada medium WP dengan pikloram 15 atau 30µM dikombinasikan dengan BAP 0,5µM.
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Lestari dan Yunita (2006) terhadap eksplan embrio zigotik padi menunjukan bahwa penambahan prolin 100 mgL-1 pada media yang sudah mengandung 2,4-D 3 mgL-1, menghasilkan kalus dengan diameter lebih besar, selain itu warna kalus lebih kuning dan mudah pecah (remah).
Penelitian yang dilakukan oleh Meynarti et al. (2007) pada kultur meristem jahe putih besar yang diambil dari rimpang panen muda dan tua didapatkan induksi embrio globular pada kedua jenis eksplan yang digunakan, dengan jumlah embrio globular eksplan asal rimpang yang dipanen tua lebih banyak dibandingkan panen muda.
Penelitian yang dilakukan oleh Rianawati et al., (2007) pada eksplan daun anggrek, penggunaan media MP (1/2 MS + 0,5 mgL- 2,4-D + 0,2 mgL- TDZ + 2 gL- pepton + 75 mlL- air kelapa + 1 gL- arang aktif) mampu menghasilkan produksi berat kalus yang lebih baik dari pada media untuk proliferasi kalus yaitu MR ((1/2 MS + 0,2 mgL- 2,4-D + 0,4 mgL- BAP + 2 gL- pepton + 75 mlL- air kelapa + 1 gL- arang aktif). Pada penelitian tersebut proses embriogenesis somatik telah terbukti tercapai dengan penggunaan media MR yang mengandung BAP 0,4 mgL- dan 2,4-D 0,2 mgL-.
Yelnitis dan Tajudin (2010) melakukan penelitian pada eksplan daun ramin yang masih muda, penggunaan 2,4-D 6.0 mgL-1 dikombinasikan dengan thidiazuron 1.5 mgL-1 dan biotin 1.5 mgL-1 merupakan perlakuan terbaik untuk induksi kalus friabel. Kalus yang dihasilkan mempunyai struktur friabel dan mudah dipisahkan, selain itu kalus yang dihasilkan berwarna putih.
Selanjutnya, Setianingrum (2010) melakukan penelitian pada eksplan pucuk jarak pagar yang telah dikecambahkan dari biji dengan menggunakan media MS, hasil yang diperoleh adalah berat kalus tertinggi sebesar 2,56 gram berhasil diperoleh pada perlakuan BAP 2 ppm + 2,4-D 0,5 ppm.
Pada penelitian terdahulu telah dilakukan tahapan untuk menginduksi terbentuknya kalus dari eksplan daun muda jarak pagar. Namun dikarenakan masih sedikitnya atau terbatasnya jumlah kalus yang terbentuk pada media induksi, maka kalus – kalus tersebut kemudian harus di proliferasikan pada media yang mengandung kombinasi zat pengatur tumbuh dan asam amino. Penentuan kombinasinya adalah dengan memilih berdasarkan hasil – hasil penelitian terdahulu dengan harapan kalus yang akan diproliferasikan nantinya mendapatkan jumlah yang banyak dan embriogenik.
Berdasarkan uraian di atas, maka penulis mencoba melakukan penelitian dengan judul “Proliferasi Kalus dan Embriogenesis Somatik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) dengan Berbagai Kombinasi ZPT dan Asam Amino”.
1.2  Tujuan
            Untuk mendapatkan kombinasi zat pengatur tumbuh dan asam amino yang terbaik dalam proliferasi kalus dan embriogenesis somatik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.).
1.3 Kegunaan
            Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumbangan pemikiran dan informasi mengenai kombinasi zat pengatur tumbuh dan asam amino terbaik dalam proliferasi kalus dan embriosomatik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.).
1.4 Hipotesis
1.      Kombinasi zat pengatur tumbuh dan asam amino memberikan pengaruh yang berbeda terhadap proliferasi kalus dan embriosomatik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.).
2.      Terdapat kombinasi zat pengatur tumbuh dan asam amino terbaik dalam proliferasi kalus dan embriogenesis somatik pada eksplan kalus asal daun muda umur 30 hari.



II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Tanaman Jarak Pagar
            Jarak pagar (Jatropha curcas Linn.) merupakan tumbuhan semak berkayu dari Famili Euphorbiaceae yang berasal dari Amerika Tengah dan telah menyebar sampai ke Afrika dan Asia (termasuk Indonesia). Berdasarkan taksonominya, jarak pagar diklasifikasikan sebagai berikut.
            Divisi               : Magnoliophyta
            Kelas               : Magnoliopsida
            Ordo                : Malpigihiales
            Famili              : Euphorbiaceae
            Genus              : Jatropha
            Spesies : Jatropha curcas L. (Hambali et al., 2006)
            Jarak pagar mempunyai sosok yang kekar, batang berkayu bulat dan pada setiap mata ruas terdapat titik tumbuh daun. Jika tertoreh batang tanaman ini akan mengeluarkan getah (Nurcholis et al., 2006). Menurut Hambali dan Eliza (2007), jarak pagar dapat hidup dan berkembang dari dataran rendah sampai dataran tinggi, curah hujan yang rendah maupun tinggi (300 – 2.380 ml/tahun), suhu antara 20 - 26°C. Karena sifat tersebut tanaman jarak pagar mampu tumbuh pada tanah berpasir, berbatu, lempung ataupun tanah liat, sehingga jarak pagar dapat dikembangkan pada lahan kritis.
            Daun jarak pagar adalah daun tunggal, bersudut 3 atau 5, tulang daun menjari dengan 5 – 7 tulang utama. Daunnya berwarna hijau dengan panjang tangkai daun antara 4 – 15 cm, panjang helai daun 6 – 16 cm dan lebar 5 – 15 cm (Priyanto, 2007). Pada daun yang sedang berkembang, terdapat sebongkah sel meristem pada ketiak daun, antara daun dan batang. Bongkah ini merupakan bagian rudiment kuncup ketiak, dan jika bagian ini berkembang penuh, maka akan terjadi susunan yang sama dengan kuncup ujung (tunas). Perkembangan kuncup ketiak ini akan mengalami dorman pada awal perkembangannya, atau mungkin akan menjadi pucuk cabang (Loveless, 1991).
            Bunga tanaman jarak pagar berwarna kuning kehijauan yang berupa bunga majemuk berbentuk malai, berumah satu dan uniseksual, kadang – kadang ditemukan bunga hermaprodit. Jumlah bunga betina 4 – 5 kali lebih banyak dari bunga jantan. Bunga mempunyai 5 mahkota berwarna keunguan (Hambali et al., 2006).
            Buah jarak pagar berbentuk bulat dengan diameter 2 – 4 cm dengan permukaan tidak berbulu (gundul). Berwarna hijau jika masih muda, kemudian hijau kekuningan, kuning, kuning kehitaman, dan hitam. Buah umumnya terbagi dalam 3 ruang yang masing – masing terisi oleh satu biji (Priyanto, 2007).
            Biji jarak pagar berbentuk lonjong, berwarna coklat kehitaman dengan ukuran panjang 2 cm dan tebal 1 cm, serta berat 0,4 – 0,6 gram/biji. Kandungan minyak yang terdapat dalam biji baik cangkang maupun buah berkisar 25 – 35% berat kering biji (Prihadana R, 2007). Biji yang matang ditandai dengan perubahan warna kulit buah dari hijau menjadi kuning. Biji ini yang banyak mengandung minyak dengan rendemen 25 – 30% dan mengandung toksin sehingga tidak dapat dimakan (Hariyadi, 2005).
2.2 Proliferasi Kalus
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Dalam keadaan in vivo, kalus pada umumnya terbentuk dari bagian luka akibat serangan infeksi mikroorganisme : Agrobacterium tumifaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stres (George & Sherrington, 1984 dalam Gunawan, 1988). Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur in vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, didalam media yang mengandung auksin dan terkadang sitokinin. Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman. Organ tanaman yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon, dan batang muda, merupakan bagian yang mudah untuk mengalami proses dediferensiasi dan menghasilkan kalus.
Terbentuknya kalus merupakan akibat dari adanya perlukaan pada permukaan eksplan dan pengaruh perlakuan zat pengatur tumbuh yang diberikan pada medium kultur. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan.
Kalus embriogenik mempunyai struktur friabel, noduler dan berwarna putih atau kekuningan. Kalus embriogenik juga dicirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti besar, vakuola kecil – kecil dan mengandung butir pati (Purmaningsih 2002, Kalimuthu et al., 2007). Menurut Indrianto (2002) insiasi kalus embriogenik terjadi sebagai respon dari stres akibat pangaruh konsentrasi auksin yang relatif tinggi. Proliferasi kalus ditandai dengan semakin bertambahnya massa kalus akibat pertambahan embrio yang baru. Pertambahan massa kalus terlihat dengan ukuran diameter kalus yang semakin besar.
2.3 Embriogenesis Somatik
            Embriogenesis somatik merupakan suatu proses perkembangan embrio lengkap dari sel – sel vegetative atau sel – sel somatic yang diperoleh dari berbagai sumber eksplan. Inisiasi dan diferensiasi embrio somatic tidak melibatkan proses seksual. Tahap perkembangan embrio somatik menyerupai embrio zigotik. Secara spesifik tahap perkembangan tersebut dimulai dari fase globular, fase hati, fase torpedo, dan planlet (Henry et al., 1998 dalam Gaj, 2001).
            Rice et al. (1992) menyatakan bahwa embriogenesis somatik merupakan teknik yang paling menjanjikan untuk perbanyakan dalam waktu cepat pada tanaman pertanian. Embrio – embrio somatik dapat muncul langsung dari permukaan eksplan, misalnya pada eksplan kotiledon Cucumis sativus (Ladyman dan Girard, 1992) dan tunas Foeniculum vulgare (Theiler – Hedtrich dan Kagi, 1992) atau setelah fase penggandaan yang melibatkan pembentukan kalus, seperti pada Irish pumila (Radojevic et al., 1987), Fuchsia (Dabin dan Beguin, 1987), dan Swainsona formosa (Zulkarnain, 2003).
Embrio somatik dapat terbentuk melalui dua jalur, yaitu secara langsung maupun tidak langsung (melewati fase kalus). Embriogenesis somatik langsung adalah suatu perkembangan embrio secara langsung dari eksplan aslinya. Sedangkan embriogenesis somatik secara tidak langsung adalah pembentukan embrio yang melewati fase kalus, suspensi sel, sel atau sekelompok sel embrio somatik. Keberhasilan akan dicapai apabila kalus atau sel yang digunakan bersifat embriogenik yang dicirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti besar, vakuola kecil – kecil dan mengandung butir pati (Purmaningsih 2002, Kalimuthu et al., 2007).
Menurut Ammirato (1983) Faktor – faktor yang mempengaruhi regenerasi tanaman melalui jalur embriogenesis diantaranya adalah eksplan (embriogenesis langsung umumnya dari eksplan yang juvenile), media kultur (mencakup komponen penyusun media), zat pengatur tumbuh (aukisin merupakan salah satu zpt yang paling banyak digunakan untuk induksi embriogenesis), cahaya (embriogenesis biasanya terjadi pada intensitas cahaya yang rendah atau dalam kondisi yang gelap), jenis kultur (kultur media padat, semi solid atau media cair), dan genotip (sumber bahan tanam yang digunakan).
Wattimena (1992), beberapa faktor yang perlu diperhatikan selama kultur embriogenesis adalah :
-       Pada tahap inisiasi embrio somatik, sel embriogenik akan dihasilkan jika dikulturkan pada media yang mengandung auksin.
-       Pada awal proses embriogenesis, perlu dilakukan subkultur sel atau kalus embrionik ke media dengan auksin rendah, atau bahkan tanpa auksin.
-       Pemberian nitrogen perlu dilakukan dan sangat dikehendaki dalam pembentukan organ, NH4+ atau dalam bentuk asam amino glutamin ataupun alanin, dan NO3- harus tetap ada dalam media. Penambahan kasein hidrolisat dilakukan untuk menambah ketersediaan NO3- dan NH4+.
-       Pada embriogenesis kultur suspensi, sebaiknya dilakukan sub kultur untuk menginduksi terjadinya sel – sel yang embrionik, serta menghindari auksin yang terlalu tinggi atau bahkan tidak menggunakan auksin sama sekali.
2.4  Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Embriogenesis Somatik
2.4.1   Eksplan
Jenis eksplan adalah faktor awal yang menentukan keberhasilan kultur jaringan. Meskipun masing-masing sel tanaman memiliki kemampuan totipotensi, namun masing-masing jaringan memiliki kemampuan yang berbeda-beda untuk tumbuh dan beregenerasi dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, jenis eksplan yang digunakan untuk masing-masing kultur berbeda-beda tergantung tujuan pengkulturannya. Eksplan dapat berasal dari seluruh bagian tubuh tumbuhan seperti daun, batang, hipokotil, akar, dan bunga serta dapat juga termasuk sel yang terspesialisasi lebih tinggi seperti mesofil daun, epidermis, dan butir polen (Srivastava, 2002). Pierik (1997) mengemukakan tiga aspek utama dalam pemilihan bahan eksplan, yaitu genotip, umur, dan kondisi fisiologis bahan tersebut.
Daun muda mempunyai sifat meristematis sehingga sel – sel yang menyusun jaringan masih aktif membelah. Pada daun yang masih meristematis disimpan hormon auksin. Menurut Suryowinoto (1996), penambahan auksin yang lebih stabil seperti 2,4-D cenderung menyebabkan terjadinya pertumbuhan kalus dari eksplan.
Walaupun tanaman dapat diperoleh dari sejumlah genotip, kemampuan regenerasi setiap genotip sangat berbeda (Tomes, 1985). Pengaruh genotip pada proliferasi sel dapat dilihat pada kapasitas regenerasinya. Pada umumnya tanaman dikotil lebih mudah berproliferasi pada kultur in vitro dibandingkan tanaman monokotil.
Umur eksplan juga sangat berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut untuk tumbuh dan beregenerasi. Hartmann et al. (1990) menyatakan bahwa jaringan – jaringan yang sedang aktif tumbuh pada awal masa pertumbuhan biasanya merupakan bahan eksplan yang paling baik. Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan dinding sel yang belum kompleks sehingga lebih mudah dimodifikasi dalam kultur dibandingkan jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur biasanya dilakukan dengan menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil, inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan dapat membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.
Kondisi fisiologis eksplan memiliki peranan penting bagi keberhasilan teknik kultur jaringan. Pierik (1997) menyatakan bahwa pada umumnya bagian – bagian vegetatif lebih siap beregenerasi daripada bagian – bagian generatif. Eksplan mata tunas yang diperoleh dari tanaman yang sedang istirahat, lebih sulit berproliferasi daripada mata tunas yang diperoleh dari tanaman yang sedang aktif tumbuh. Hal itu sama halnya dengan kasus dormansi pada eksplan biji.
2.4.2   Media kultur
Fungsi utama media menurut Widarto (1996) adalah mensuplai nutrisi dan zat pengatur tumbuh. Dari sekian banyak jenis media dasar yang digunakan dalam teknik kultur jaringan, media yang dikembangkan oleh Murashige dan Skoog (MS) telah digunakan secara luas pada kultur sel dan kultur suspensi sel. Keuntungan penggunaan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya yang tinggi (Wetherell dan Constabel, 1991). Collin dan Edwards (1998) menambahkan bahwa media MS merupakan media yang umum digunakan dan dengan kandungan hara makro yang tinggi.
2.4.3 Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
Pemakaian zat pengatur tumbuh didasari oleh fungsi atau peranan dan kestabilan hormon. Zat pengatur tumbuh auksin, sitokinin, dan giberelin adalah hormon – hormon yang mempunyai peran ganda dalam propagasi secara in vitro, hormon – hormon tersebut sering digunakan karena mempunyai kemampuan untuk merangsang pertumbuhan eksplan.
Menurut Wetherell (1982) bahwa zat – zat pengatur tumbuh tersebut untuk setiap spesies dan bagian – bagian tanaman sangat berbeda – beda, juga tergantung dari tujuan masing – masing tahap dalam propagasi. Wiendi et al. (1992) melaporkan bahwa dalam aplikasinya di dalam kultur jaringan tanaman, konsentrasi efektif untuk masing-masing zat pengatur tumbuh berbeda. Penentuan taraf konsentrasi disesuaikan dengan tipe organ atau eksplan, metode kultur jaringan, dan tingkat kultur jaringan (pembuatan kalus, induksi tunas, induksi akar, dan lain-lain).
2.4.3.1  Auksin
Auksin umumnya berfungsi terhadap pemanjangan sel, pembentukan kalus, dan akar adventif serta menghambat pembentukan tunas aksilar. Auksin juga terlibat dalam proses fisiologi dalam tumbuhan, antara lain fototropisme, geotropisme, inisiasi akar, produksi etilen, pembentukan kalus, perkembangan buah, partenokarpi, absisi, dan ekspresi kelamin pada tumbuhan hermafrodit.
Dalam konsentrasi rendah auksin akan memacu pertumbuhan akar adventif, sedangkan dalam konsentrasi tinggi mendorong pembentukan kalus (Pierik, 1987). Auksin yang sering dipakai dalam kultur jaringan adalah IAA (Indole Acetic Acid), 2,4-D (2,4 Dichlorophenoxy Acetic Acid), IBA (Indole Butyric Acid), dan NAA (Naphtalen Acetic Acid) (George dan Sherrington, 1984). Menurut Kyte dan Kleyn (1996) auksin dapat diberikan secara tunggal maupun dikombinasikan dengan sitokinin untuk menginduksi kalus.
Wetherel dan Constabel (1991) mengemukakan bahwa salah satu senyawa yang paling sering digunakan untuk menginduksi pembelahan sel adalah  asam 2,4 diklorofenoksiasetat (2,4-D). Dalam budidaya in vitro, menginduksi kalus merupakan salah satu langkah penting. Jika endosperm tanaman dikotil dipakai dan pada medium ditambahkan hormon dari kelompok auksin yaitu 2,4-D atau IAA, maka harus ditambahkan pula hormon dari kelompok sitokinin yaitu kinetin atau BAP (Suryowinoto, 1996).
Auksin yang kuat seperti 2,4-D, pikloram, dan NAA umumnya digunakan untuk merangsang terbentuknya embrio somatik (Yusnita, 2003). Purmaningsih (2002) mengemukakan bahwa 2,4-D merupakan auksin yang efektif untuk menginduksi kalus embriogenik karena cukup kuat dan tahan terhadap degradasi karena reaksi enzimatik dan fotooksidasi.
Khumaida dan Handayani (2009) melakukan penelitian pada eksplan kotiledon muda kedelai dan mendapatkan bahwa pada media proliferasi kalus embriogenik yang meliputi media MSIIA (media dasar MS, vitamin B5, sukrosa 3%, gelrite 0,2%, 5 mgL-1 2,4-D, dan 5 mgL-1 NAA) memberikan hasil yang lebih baik pada pertumbuhan kalus embriogenik.
2.4.3.2  Sitokinin
Sitokinin adalah senyawa yang dapat meningkatkan pembelahan sel pada jaringan tanaman serta mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman, sama halnya dengan kinetin (6-furfurylaminopurine) (Zulkarnain, 2009). Sitokinin merupakan senyawa pengganti adenine yang meningkatkan pembelahan sel dan fungsi pengaturan pertumbuhan. Sitokinin banyak ditemukan dalam tumbuhan. Peranannya dalam tumbuhan adalah sebagai berikut : mengatur pembelahan sel, pembentukan organ, pembesaran sel dan organ, pencegahan kerusakan klorofil, pembentukan kloroplas, penundaan senescens, pembukaan dan penutupan stomata, serta perkembangan mata tunas dan pucuk. Wattimena (1992) menjelaskan bahwa ZPT dari golongan sitokinin sangat berperan di dalam kultur jaringan antara lain berhubungan dengan proses pembelahan sel, proliferasi tunas, dan induksi organ. Sitokinin yang sering digunakan dalam kultur jaringan adalah BAP (Benzil Amino Purin) dan Kinetin (George dan Sherrington, 1984).
Pada sitokinin ada dua kelompok yang berperan penting dalam system biossay tanaman. Pertama, kelompok purin yang menghasilkan turunan BAP berperan penting dalam menginduksi respon fisiologi seperti regulasi pembelahan sel, diferensiasi jaringan dan organ serta biosintesis klorofil. Kedua, kelompok fenil urea sintetik yang menghasilkan turunan thidiazuron (TDZ: Nphenyl-N (1,2,3-thidiazol-5-yl)urea) berperan penting dalam meningkatkan biosintesis dan akumulasi sitokinin endogen (Victor et al., 1999). Selain itu, TDZ dapat menggantikan tipe adenine dalam pembentukan kultur kalus dan mikroprogasi pada spesies tanaman berkayu (Lu, 1993).
Disamping itu, penggunaan Thidiazuron dapat pula mempengaruhi penggunaan tunas aksilar. Telah banyak dilaporkan bahwa thidiazuron mempunyai aktifitas yang menyerupai sitokinin (Nielsen et al., 1993). Lu (1993) menyatakan bahwa senyawa tersebut dapat menginduksi pembentukan tunas adventif dan proliferasi tunas aksilar. Pada tanaman hias antara lain Azela, thidiazuron dapat meningkatkan proses proliferasi tunas. Demikian pula Sinaga et al. (1996) menggunakan thidiazuron untuk perbanyakan cepat tanaman Pisum sativum. Diduga, thidiazuron mendorong terjadinya perubahan sitokinin ribonukleotida menjadi ribonukleosida yang secara biologis lebih aktif (Capella et al., dalam Lu 1993).

2.4.4   Asam Amino
Beberapa asam amino atau amida yang sering memberikan hasil positif pada kultur in vitro adalah asam L-aspartatm L-asparagin, asam L-glutamat, L-glutamin, dan L-arginin. Diantara auksin kuat seperti 2,4-D, dicamba dan picloram, asam amino seperti kasein hidrolisat, L-glutamin, L-prolin, dikenal sebagai media tumbuh yang mampu menginduksi kalus embriogenik pada berbagai jenis tanaman (Ogita et al., 2001).  Asam - asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus.
Penambahan kasein hidrolisat kedalam media yang sudah mengandung 2,4-D dapat memacu pembentukan kalus yang embriogenik karena kasein hidrolisat merupakan sumber N di dalam media. Selain kasein hidolisat pemberian asam amino glutamin atau narginin pada media yang sudah mengandung auksin dapat pula meningkatkan keberhasilan pembentukan kalus embriogenik karena di dalam kloroplas, asam amino dapat berperan sebagai prekursor untuk pembentukan asam nukleat dan proses seluler lainnya (Gunawan, 1988).








III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu
            Penelitian ini dilaksanakan di Laboraturium Bioteknologi Tanaman, Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Jambi, Mendalo Darat, Jambi. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan desember sampai bulan april 2012.
3.2 Bahan dan Alat
            Bahan tanaman (eksplan) yang digunakan dalam penelitian ini adalah kalus yang berasal dari daun muda berumur 30 hari. Bahan media yang akan digunakan adalah bahan dasar media MS (Murishage dan Skoog) yang komposisi medianya terlampir pada Lampiran 1, zat pengatur tumbuh TDZ (Thidiazuron), 2,4-D (2,4 Dichlorophenoxy Acetic Acid), glutamin, BAP (Benzil Amino Purin), CH (Casein Hydrolisat), dan Prolin sebagai zat pengatur tumbuh yang konsentrasinya sesuai perlakuan. Sebagai bahan pemadat digunakan agar – agar powder 8gL-1,  sukrosa 30 gL-1, manitol, alkohol 70%, alkohol 96%, aquadest, spritus, KOH 0,1 N, dan HCl 0,1 N.
            Alat – alat yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, hot plate, timbangan analitik, botol kultur, magnetic stirrer, pH meter, plastic kaca, gelas piala, gelas ukur, scalpel, pinset, pipet, lampu spirtus, korek api, kertas label, petridis, millimeter block, mikroskop cahaya, kertas saring, dan luv.

3.3 Rancangan Penelitian
            Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dengan Sembilan perlakuan media, yaitu :
-          T1 = MS + 1 ppm TDZ + 1 ppm 2,4-D + 100 ppm Glutamin
-          T2 = MS + 2 ppm BAP + 1 ppm 2,4-D + 100 ppm Glutamin
-          T3 = MS + 1 ppm TDZ + 1 ppm 2,4-D + 100 ppm Kasein Hidrolisat
-          T4 = MS + 2 ppm BAP + 1 ppm 2,4-D + 100 ppm Kasein Hidrolisat
-          T5 = MS + 1 ppm TDZ + 1 ppm 2,4-D
-          T6 = MS + 2 ppm BAP + 1 ppm 2,4-D
-          T7 = MS0 (tanpa gula) + 3% manitol
-          T8 = MS + Prolin 50µM
-          T9 = MS + Prolin 25µM
Dari faktor diatas diperoleh 9 perlakuan dengan 3 ulangan, sehingga terdapat 27 satuan percobaan. Pada masing – masing satuan percobaan terdapat 4 botol kultur sehingga terdapat 108 botol kultur. Tiap botol masing – masing ditanam 1 eksplan dan semua populasi diamati.
3.4 Metode Penelitian
3.4.1 Sterilisasi Alat
            Untuk mencegah terjadinya kontaminasi, sebelum penelitian dimulai semua alat yang akan digunakan seperti petridish, pinset, scalpel, dan botol kultur dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air sampai bersih. Kemudian disterilkan dalam autoklaf selama 1 jam dengan tekanan 17,5 psi dan suhu 121°C.

3.4.2 Pembuatan Media
            Media yang dibuat adalah media MS dengan kombinasi ZPT dan asam amino sesuai perlakuan. Untuk memudahkan pembuatan media, maka terlebih dahulu disiapkan larutan stok. Semua larutan stok dipipet sebanyak yang dibutuhkan kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala 250 mL
            Setelah semua larutan stok dimasukan kedalam gelas piala, kemudian dimasukkan gula dan agar ke dalamnya, kemudian tepatkan pada volume 250 mL dengan menambahkan aquades. Setelah itu pH diatur 5,6 – 5,8 dengan menambahkan HCL 0,1 N atau KOH 0,1 N, larutan dipanaskan sambil diaduk dengan stirrer. Pemanasan dihentikan bila larutan telah mendidih.
            Media tersebut dituangkan ke dalam botol kultur, kemudian ditutup dengan plastik tahan panas, diikat dengan karet gelang dan diberi label sesuai perlakuan. Setelah itu media disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 17,5 psi selama 30 menit.
3.4.3 Persiapan dan Subkultur Eksplan
            Subkultur eksplan dilakukan di dalam laminar air flow cabinet (LAFC) yang telah disterilkan dengan sinar ultraviolet selama minimal satu jam dan disemprot alkohol 70%. Semua bahan dan alat yang akan dimasukkan ke dalam LAFC juga disemprot alkohol 70%.
            Setelah itu kalus yang berhasil ditumbuhkan dari eksplan daun kemudian dipotong – potong dengan ukuran yang hampir sama dengan menggunakan pisau scalpel di dalam petridish untuk disubkulturkan di dalam media proliferasi kalus sesuai perlakuan. Kalus berasal dari hasil induksi kalus yang berasal dari eksplan daun muda umur 30 hari yang dikulturkan dalam media yang sama dengan media proliferasi. Pada saat penanaman mulut botol menghadap ke bunsen, hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Kemudian mulut botol ditutup dengan plastik tahan panas dan diikat dengan karet gelang. Botol diberi label sesuai perlakuan. Setiap botol kultur berisi 1 eksplan.
3.4.4 Pemeliharaan
            Pemeliharaan meliputi menjaga kebersihan, pemisahan eksplan atau media yang telah terkontaminasi oleh mikroorganisme dari ruang inkubasi. Penyemprotan lokasi percobaan dan botol – botol eksplan dilakukan setiap hari dengan alkohol 70%.
3.5 Variabel yang Diamati
3.5.1 Bobot segar kalus
            Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian, pada masing – masing perlakuan. Bobot segar kalus yang telah dipanen ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik. Penghitungan bobot segar kalus dihitung dengan cara menghitung selisih antara bobot akhir  dan bobot awal.
3.5.2 Diameter kalus
            Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian, pada masing – masing perlakuan. Diameter kalus yang telah dipanen kemudian diukur diameternya dengan menggunakan kertas millimeter block dan kaca pembesar (luv). Penghitungan diameter kalus dihitung dengan cara menghitung selisih antara diameter akhir  dan diameter awal.

3.5.3 Karakteristik kalus
            Pengamatan dilakukan dengan mengamati karakteristik kalus seperti :
a.      Warna kalus
Pengamatan dilakukan pada setiap eksplan kalus pada akhir penelitian. Setiap eksplan diamati warna kalus yang terbentuk seperti warna putih, kuning, cokelat, dan hijau.
b.      Struktur kalus
Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian, dimana setiap eksplan kalus dilihat struktur yang terbentuk dan dibedakan menjadi kalus dengan struktur kompak dan kalus struktur remah.
3.5.4   Presentase kalus embriogenik secara mikroskopik
Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah kalus embriogenik yang terlihat dibawah mikroskop pada akhir penelitian.
3.6 Analisis Data
            Data hasil pengamatan akan dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam kemudian dilanjutkan dengan Uji Lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT) pada taraf α = 5%.


DAFTAR PUSTAKA

Akbar, Yaakob, Kamarudin, Ismail, Salimon. 2009. Caracteristic and Composition of Jatropha Curcas Oil Seed from Malaysia and its Potential as Biodiesel Feedstock. Eur.J.Sci.Res. 29:396-403.
Ammirato, P.V. 1983. Embryogenesis. In D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato, and Y. Yamada. (Eds.). Handbook of Plant Cell Culture 1:82-123.
Collin, H. A and S. Edwards. 1998. Plant Cell Culture. BIOS Scientific Publishers. London. 158p.
Dabin, P. dan F. Beguin. 1987. Somatic Embryogenesis in Fuchsia. Acta Horticulturae 212.
Ehsanpour, A. A. 2002. Induction of somatic embryogenesis from endosperm of oak (Quercus castanifolia). In A. Taji and R. Williams (ed.). The importance of plant tissue culture and biotechnology in plant science. Univ. of New England Unit, Australia. P.273 – 277.
Gaj, M.D. 2001. Direct somatic embryogenesis as a rapid and efficient system for in vitro regeneration of Arabidopsis thaliana. Plant Cell and Organ Culture 64:39-46.
George, E. F. Dan Sherrington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Ltd, England.
Gunawan, L.W. 1988. Teknik Kultur  Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.
Hambali dan Eliza. 2007. Jarak Pagar, Tanaman Penghasil Biodiesel. Penebar Swadaya. Jakarta.
Hambali, E., Suryani, A., Dadang, Ariyadi, Hanafie, H., Rekso-wardojo, I.K., Rivai, M., Ihsanur, M., Suryadarma, P., Tjitrosemito, S., Soerawidjaja, T.H., Prawitasari, T., Prakoso, T., dan W. Purnama. 2006. Jarak Pagar Tanaman Penghasil Biodisel. Penebar Swadaya, Jakarta.
Hariyadi, 2005. Sistem Budidaya Tanaman Jarak Pagar (Jatropa curcas L.). Makalah Seminar Nasional Pengembangan Jarak Pagar Untuk Biodiesel dan Minyak Bakar. Bogor.
Hartman, H.T., D.E. Kester, dan F.T. Davis-Jr. 1990. Plant Propagation: Principles and Practices. Englewood Clifts. New Jersey: Prentice-Hall International, Inc.
Indrianto, A. 2002. Kultur jaringan tumbuhan. Fak. Biologi UGM. Yogyakarta. 134 hal.
Jimenez, V.M. 2001. Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones. R. Bras. Fisiol. Veg. 13(2): 196-223.
Kalimuthu, K., S. Paulsamy, R. Senthilkumar dan M. Sathy. 2007. In vitro Propagation of the Biodiesel Plant Jatropha curcas L. Plant Tissue Culture & Biotechnology Journal 17(2): 137-147
Khumaida, N., dan Tri Handayani. 2009. Induksi dan Proliferasi Kalus Emriogenik. Embryogenic Callus Induction and Proliferation on Several Soybean Genotype. J. Agron. Indonesia 38 (1) : 19 - 24 (2010).
Kyte, L. and Kleyn, J. 1996. Plant from Test Tubes an Introduction to Micropropagation. Third Edition. Timber Press Inc. Washington.
Ladyman, A.R. dan B. Girard. 1992. Nonhormonal Factors that Improve the Multiplication and Development of Somatic Embryos of Cucumber (Cucumis sativus L.). Acta Horticulturae 300.
Lestari, E. G dan Yunita, Rosa. 2006. Induksi Kalus dan Regenerasi Tunas Padi Varietas Fatmawati. Bal. Agron. (36) (2) 106 – 110 (2008).
Loveless, A.R. 1991. Prinsip – prinsip Biologi Tumbuhan untuk Daerah Tropik. Penerbit PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 408 halaman.
Lu, C.Y. 1993. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro Cell Dev. Biol. 29:92-96.
Meynarti, S.D.I., Otih, R., dan Nurul Khumaida. 2007. Pengaruh Umur Eksplan Terhadap Keberhasilan Pembentukan Kalus Embriogenik Pada Kultur Meristem Jahe (Zingiber officinale Rosc).
Nielsen, J.M., K. Brandt, and J. Hansen. 1993. Long term effects of thidiazuron are intermediate between benzyladenine, kinetin or isopentenyl adenine in Micanthus sinensis. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 35:173-179.
Nuscholis, Mohammad dan Sumarsih, Sri. 2006. Jarak Pagar dan Pembuatan Biodiesel. Yogyakarta: Kanisius.
Ogita S, Sasamoto H, Yeung EC and Thorpe TA. 2001. The Effects of Glutamine on The Maintenance of Embryogenic Cultures of Cryptomeria japonica. In vitro Cell Dev. Plant. 15,473-497.


Untuk Hasil Dapat di Lihat di : http://www.sumberajaran.com/2015/04/hasil-penelitian-kultur-jaringan-jarak.html

Komentar