Jurnal Kultur Jaringan 'Tanaman Sukun'




Peningkatan Keragaman Tanaman Sukun (Artocarpus communis)  melalui Kultur In Vitro dan Irradiasi Sinar Gamma dalam Upaya Mendapatkan Klon Unggul

           Netti Herawati, Benni Satria, Reni Mayerni dan Ardi*)


ABSTRAK
Penelitian bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi ZPT Auksin dan Sitokinin yang terbaik untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangan eksplan tanaman sukun membentuk  sebagai sumber plasma nutfah,  dan mendapatkan konsentrasi zat osmotikum dan retardan yang terbaik pada media kultur untuk menghambat pertumbuhan tunas plantlet pisang dalam usaha konservasi plasma nutfah secara in vitro.
Percobaan ini  terdiri dari dua tahap. Percobaan tahap pertama mengunakan rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL),  dimana media kultur  yang digunakan adalah Media MS. Kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh yang diperlakukan pada media kultur adalah : A) 1,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10  pprn Kinetin ;  B). 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn. Kinetin; C). 3,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn Kinetin; D).1,00 ppm 2,4-D + 3,5  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; E). 2,00 ppm 2,4-D + 3,50  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; F). 3,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm. BAP + 0, 10 ppm Kinetin, sehingga ada  18 macam kombinasi perlakuaan,  tiap kombinasi perlakuan terdiri dari 3 ulangan.
Percobaan tahap kedua merupakan percobaan tahap mendapatkan dosis irradiasi sinar gamma yang sesuai dengan LD 50 = ED 50. Dimana kalus,tunas, dan plantlet hasil percobaan tahap I di irradiasi dengan sinar gamma  pada berbagai dosis.  Adapun dosis radiasi yaitu : 1).0,00 Gy; 2).15,00Gy; 3).30,00 Gy;4).45,00 Gy; 5).60,00 Gy;  6).75,00 Gy; dan 7).90,00 Gy.  Penelitian inii dilakuka di laboratorium Radioisotop Batan Pasar Jum’at.  Tiap satuan percobaan diulang 3 kali, dan menggunakan 25 eksplan per observasi, sehingga diperoleh  600 unit satuan percobaan. MS yang diperkaya dengan 3,00 ppm 2,4-D. Selanjutnya kalus yang terbentuk disubkultur 5 kali pada media MS dengan konsentrasi 2,4-D 3,00 ppm. Data hasil pengamatan dianalisis dengan sidik ragam, dan bagi yang berbeda nyata dilanjutkan uji Duncan Multiple New Range Test (DMNRT) pada taraf  nyata 5 %.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa  perlakuan kombinasi konsentrasi 2,00  ppm  2,4-D +  1,75 ppm BAP + 0,10 ppm  Kinetin pada media MS menunjukkan hasil yang tertinggi dalam mendorong    eksplan yang hidup, mengalami pencoklatan yang terendah, saat terbentuk kalus tercepat, persentase eksplan membentuk kalus tertinggi, persentase terjadinya keragaman somaklonal kalus dan selanjutnya pada kombinasi konsentrasi 1,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm Bap + 0,10 ppm Kinetin pada Media MS menunjukkan persentase eksplan membentuk shootlet tertinggi.  Selanjutnya hasil percobaan tersebut sebelum diperlakukan pada percobaan tahap dua yaitu tahap peningkatan keragaman somaklonal hasil in vitro dengan irradiasi sinar gamma, terjadi bencana gempa bumi sehingga seluruh materi percobaan hasil penelitian tahap 1 tidak dapat digunakan karena seluruh jaringan eksplan mengalami kematian. Selanjutnya karena lampu mengalami pemadaman selama sebulan pasca gempa maka peneliti mencoba melakukan kembali percobaan dari awal pada bulan Oktober tetapi hasilnya sampai bulan November belum dapat digunakan untuk penelitian tahap kedua. Peneliti tetap akan menyelesaikan penelitian tahap kedua nantinya. Hasil penelitian tahun pertama ini nantinya dapat digunakan untuk penelitian pada tahun kedua.
Kata-kata kunci : eksplan,Shootlet, in vitro, 2,4-D, BAP, Kinetin, Somaklonal

*).  Tim Peneliti Hibah Penelitian Strategis Nasional dan Dosen Fakultas Pertanian Unand

1. Pendahuluan


Sukun (Artocarpus communis) merupakan salah satu tanaman alternatif dalam pengembangan diversivikasi pangan sehingga tingkat konsumsi masyarakat terhadap beras dapat dikurangi, disamping itu dapat membantu meningkatkan produktivitas lahan kering dan dapat dijadikan tanaman penghijauan untuk mencegah erosi.
Produktivitas dan kualitas hasil sangat tergantung pada bahan tanaman yang digunakan. Makin baik bahan tanaman makin tinggi produksi dan kualitas hasil yang diperoleh. Sampai saat ini bibit sukun diperbanyak melalui cangkok dan trubusan akar, mengingat sukun tidak mempunyai biji, sehingga persentase tumbuh bibit  dari hasil perbanyakkan vegetatif konvensional  sangat rendah.  Disamping itu kurangnya dilakukan peremajaan tanaman, dan banyaknya pohon sukun telah tua ditebang orang, sehingga bila tidak dilestarikan tanaman ini terancam akan punah. 
Persoalan utama yang dihadapi pada tanaman sukun adalah keragaman genetiknya   rendah, hal ini dapat dilihat dari spesies  tanaman sukun hanya satu jenis, disamping itu tanaman ini tidak memiliki biji. Persoalan lain yang dihadapi pada tanaman sukun adalah  produktivitas hasilnya rendah baik pada lahan subur apalagi pada lahan marginal.
Tanaman sukun selama ini belum ada dilakukan usaha pemuliaan dalam upaya meningkatkan keragaman genetik guna memperoleh karakter-karakter yang diharapkan nantinya seperti tanaman dengan perakaran efektif dan banyak, toleran berbagai cekaman lingkungan ,umur genjah, lebat dan berkualitas.
Dalam menghadapi permasalahan di atas maka penerapan metoda pemuliaan  melalui kultur in vitro dan irradiasi sinar gamma , merupakan salah satu alternatif yang dapat diusahakan.
Tujuan Penelitian adalah: Mendapatkan konsentrasi 2,4-D yang tepat guna meningkatkan keraman somaklonal dan Mendapat dosis irradiasi  sinar gamma guna meningkatkan keragaman   genetik pada LD 50 = ED 50.
Teknik kultur in vitro tanaman sukun, dapat menyediakan bibit dalam jumlah banyak pada waktu yang singkat tanpa merusak pohon induk, tidak tergantung pada musim, bibit yang dihasilkan bebas hama dan penyakit sistemik dan yang paling penting bagi pemuliaan adalah adanya kemungkinan untuk mendapatkan keragaman somaklonal. Keragaman somaklonal sukun melalui perlakuan 2,4-D dapat timbul dalam frekwensi yang rendah, tetapi sebagian besar keragaman yang timbul berasal dari dari keragaman genetik yang terjadi di dalam in vitro pada fase kalus,terutama apabila fase kalus diperpanjang.
            Shepard (1982) mengatakan keragaman somaklonal dalam perbanyakan vegetatif tebu  melalui kultur in vitro akan muncul sekalipun dalam frekwensi yang rendah, sebagai akibat penggunaan bahan kimia murni ataupun lingkungan terkendali mengalami gangguan,terutama melalui fase pertumbuhan kalus dan relatif panjang (George dan Sherrington, 1984; Hartman dan Kester, 1983; Satria,Fauza dan Kasli, 1998).
            Keragaman ini  dapat dimanfaatkan melalui sifat spesifik yang menguntungkan seperti : tahan terhadap penyakit  tertentu, kemungkinan pertumbuhan lebih cepat, dan mempunyai penampilan anatomi dan morfologi yang beragam.
            Seperti halnya pekerjaan in vitro, dalam kultur in vitro juga dapat menggunakan induksi dari luar.  Dimana keragaman somaklonal yang timbul tidak hanya mengandalkan dari kultur secara spontan juga dapat ditingkatkan melalui induksi mutasi buatan dengan menggunakan mutagen, baik secara kimia maupun fisika.
            Mutasi buatan merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk memperbaiki sifat-sifat agronomi melalui modifikasi bahan-bahan genetis tanaman sehingga ada kemungkinan menghasilkan keragaman genotipe diantara tanaman yang dimutasi.
            Untuk mendapatkan individu tanaman dengan komposisi genetik unggul yang diharapkan maka populasi dasar  mutan-mutan tersebut nantinya perlu diseleksi melalui serangkaian pengujian yang sesuai dengan tujuan penelitian yang dikehendaki.
            Seperti  hasil pengujian mutan kedelai M1 dan M6 toleran masam pada tanah ultisol secara in vivo, menunjukkan adanya kelompok genotipe mutan M5 dan M6 yang memiliki kemampuan berproduksi lebih tinggi dibandingkan tetuanya (Ardi, Jamsari, Satria, dan Latifah, 1993 - 1998).
            Aswaldi tahun 1998 cit . Satria, Dwipa, dan Jamsari, 1999 ) melaporkan bahwa penginduksian mutasi pada eksplan batang dan buku tanaman ubi jalar menghendaki dosis irradiasi yang rendah (£ 5 Gy) dan teknik pengkombinasian irradiasi dengan kultur in vitro dapat memperpendek waktu yang dibutuhkan dalam pemuliaan ubi jalar.
Wattimena (1998) melaporkan bahwa eksplan kalus yang berasal dari daun kentang setelah diirradiasi sinar gamma pada dosis 5 Gy, ternyata dapat mendorong pertumbuhan, kalus, rootlet, berat rootlet, dan inisisasi shootlet dan plantlet.  Pertumbuhan kalus pada media MS dengan 1 mg/l NAA, 2 mg/l IAA dan 0.01 mg/l BA, toleran terhadap dosis radiasi yang lebih tinggi sampai 30 Gy.
Selanjutnya Fauza (2003) melaporkan bahwa aplikasi sinar gamma dengan dosis 1, 2, dan 3 krad pada benih dapat meningkatkan kergaman genetik tanaman manggis, dan irradisi snar gamma dengan dosisi 1 krad memperlihatkan variabilitas genetik yang lebih luas berdasarkan profil pola pita DNA hasil analisis RAPD.

2.  Metode Penelitian
2.1.   Tempat dan waktu
            Percobaan  ini akan dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian, Universitas andalas; Laboratorium Batan Pasar Jum’at,Jakarta ; Laboratorium Bioteknologi,Genetika dan Pemuliaan Tanaman Faperta Unand; Rumah setengah bayang dan Kebun Percobaan Fakultas Pertanian Unand Padang. Percobaan ini direncanakan berlangsung selama tiga (3) tahun; Penelitian ini dimulai Februari  2009 sampai Desember 2011 (Penelitian tahun pertama sampai tahun ketiga).  Bagan alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 1 dan jadwal penelitian terlampir pada Lampiran 1.

2.2.   Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah tunas sukun, sebagai sumber eksplan untuk kultur in vitro yang diambil dari daerah Padang Pariaman; kalus,tunas, dan plantlet sebagai sumber bahan tanam untuk dirradiasi sinar gamma; medium MS, B5 dan WPM(Lampiran 2, 3, dan 4 ), agar difco sebagai bahan pemadat 7 g/l media, sebagai sumber energi digunakan sukrosa 20 g/l media (untuk penelitian tahap I), sukrosa 15 g/l media (untuk penelitian tahap regenerasi), sukrosa 10 g/l media (untuk penelitian tahap subkultur).  Zat pengatur tumbuh yang digunakan 2,4-D, NAA, BAP dan Kinetin (sesuai dengan perlakukan); mutan kalus, tunas dan plantlet hasil irrradiasi sinar gamma.
Penggunaan irradiasi sinar gamma sesuai dengan dosis perlakuan yang diberikan,dan senyawa fenol digunakan arang aktif 2 g/l media.  Bahan-bahan sterilan yang digunakan adalah Tween 20, Agrimycin, Benlate, alkohol 90 %, dan 70 %, Na-hypoklorit, asam ascorbit, dan aquades steril, sedangkan untuk uji kromosom digunakan zat pewarna, selanjutnya uji keragaman genotipe  (uji isozim) digunakan bahan buffer gel, buffer elektroda, buffer ekstraksi, gel pati, ekstraksi enzim, elektroforesis, pewarna, test kromosom,dan seluruh bahan dan alat yang digunakan untuk analisis keragaman genetik (RAPD).
Pada tahap aklimatisasi di seed bed , polibag dan di kebun percobaan digunakan campuran media aklimatisasi (v/v) yaitu : tanah,  pasir, pupuk kandang,dan sekam (sesuai dengan perlakukan).  Sebagai desinfektan adalah Curater 3G.  Pemakaian pupuk dasar yaitu pupuk Urea, SP-36, dan KCl dilakukan setelah bibit sukun dipindahkan ke kebun percobaan.
Alat-alat yang digunakan meliputi antara lain: timbangan analitik, gelaspiala, gelas ukur, labu ukur, corong gelas, kertas saring, pemanas elektrik, alat suntik, aluminum foil, pH meter, botol semprot, hand sprayer, pipet isap, bola isap, pinset, scalpel, gunting, petridish, botol kultur, pemanas elektrik, oven, lemaries, autoklave, elektroforesis, alat irradiasi sinar gamma, Laminar Air Flow Cabinet, bola lampu, AC, rak kultur, seed bed, polibag, cangkul, sprayer, RAPD dan lain-lain.

3.3.  Perlakuan
a.  Tahap I : Mendapatkan metode baku kultur in vitro
     Percobaan merupakan tahap mendapatkan  metode baku kultur in vitro yang tepat guna meningkatkan keragaman somaklonal tanaman sukun.
     Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D, BAP dan Kinetin yang terdiri dari 6 taraf,yaitu : A) 1,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10  pprn Kinetin;  B). 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn. Kinetin; C). 3,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn Kinetin; D).1,00 ppm 2,4-D + 3,5  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; E). 2,00 ppm 2,4-D + 3,50  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; F). 3,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm. BAP + 0, 10 ppm Kinetin, sehingga ada  18 macam kombinasi perlakuaan.
 Tiap kombinasi perlakuan terdiri dari 3 ulangan,masing-masing ulangan terdiri dari  17 botol  kultur sehingga jumlah satuan unit percobaan seluruhnya adalah 918 botol kultur, dan  hasill kultur eskplan tunas sukun berupa kalus dilakukan subkultur 5 kali pada media MS yang diperkaya dengan 3,00 ppm 2,4-D. Selanjutnya kalus yang telah disubkultur 5 kali dilihat keragaman somaklonal melalui seleksi karakter dan pengamatan penampilan morfologis. Data hasil pengamatan dianalisis dengan sidik ragam, dan bagi yang berbeda nyata dilanjutkan uji Duncan Multiple New Range Test (DMNRT) pada taraf  nyata 5 %
 Penelitian ini dilakukan di laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan dan laboratorium Bioteknologi,Genetika dan Pemuliaan Tanaman Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian Unand.

b.  Tahap II :  Irradiasi sinar gamma dan regenerasi mutan sukun
            Percobaan ini merupakan tahap mendapatkan dosis irradiasi sinar gamma yang sesuai dengan LD 50 = ED 50. Dimana kalus,tunas, dan plantlet hasil penelitian tahap I di irradiasi dengan sinar gamma  pada berbagai dosis.  Adapun dosis radiasi yaitu : 1).0,00 Gy; 2).15,00Gy; 3).30,00 Gy;4).45,00 Gy; 5).60,00 Gy;  6).75,00 Gy; dan 7).90,00 Gy.  Penelitian inii dilakuka di laboratorium Radioisotop Batan Pasar Jum’at.  Tiap satuan percobaan diulang 3 kali, dan menggunakan 25 eksplan per observasi, sehingga diperoleh  600 unit satuan percobaan.
Selanjutnya  bahan tanam (kalus,tunas, dan plantlet) sukun yang telah diiradiasi dengan sinar gamma sesuai dengan perlakuaan dilakukan sub kultur pada media WPM tanpa ZPT selama 1 minggu.  Kalus mutan sukun  diregenerasikan pada media WPM yang diperkaya dengan 0,50 NAA, 0,10 ppm Kinetin dan  3,50 ppm  selama 3 minggu,dan tunas mutan sukun diregenerasikan pada media WPM yang diperkaya dengan 3,00 ppm NAA+ 1,75 ppm BAP selama 3 minggu,dan kemudian dilakukan seleksi.  Penelitian tahap ini dilakukan dii laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan, dan laboratorium Bioteknologi,Genetika dan Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP Fakultas Pertanian Unand, Padang.

3.4.  Pelaksanaan
I.  Percobaan  tahap pertama
            Sebelum pembuatan larutan stok dan media kultur terlebih dahulu dilakukan sterilisasi terhadap alat-alat yang digunakan sebagai tempat media dan botol untuk mengkulturkan eksplan.  Alat-alat seperti botol kultur, dicuci dengan diterjen, dan dibilas hingga bersih, kemudian disterilisasikan dalam autoklave dengan tekanan 15 psi pada temperatur 121oC selama 60 menit.  Botol dan petridish yang telah disterilkan disimpan dalam oven pada suhu 70 oC dan botol siap untuk digunakan.  Sedangkan alat-alat lain seperti scalpel, pinset, pisau, dan gunting juga disterilisasikan dalam autoklave terlebih dahulu dibungkus dengan kertas merang.  Sterilisasi Laminar Air Flow Cabinet (ruang pindah) dilakukan dengan penyemprotan menggunakan larutan formalin dan alkohol, serta penyinaran dengan lampu ultra violet sebelum menggunakan ruang tersebut.  Sedangkan untuk ruang inkubasi disemprot setiap hari dengan larutan alkohol.
            Menimbang bahan-bahan nutrisi (komposisi media MS seperti tertera pada Lampiran 4), selanjutnya membuat larutan stok.  Setelah bahan nutrisi ditimbang sesuai dengan jenis media yang akan dibuat, maka larutan stok nutrisi dikelompokkan menjadi 6 kelompok, dan 1 kelompok vitamin, 1 kelompok zat pengatur tumbuh.  Keenam kelompok nutrisi tersebut adalah: larutan A, larutan B, LarutanC, larutan D, Larutan E, Larutan F, dan kelompok vitamin adalah Myo-inositol, Nyacin, Pyrodoksin-HCl, dan Thiamin-HCl, serta 1 kelompok zat pengatur tumbuh 2,4-D, NAA, Kinetin, dan BAP.
            Masing-masing kelompok nutrisi ditempatkan pada satu wadah, yaitu labu ukur ukuran 1 liter, sedangkan kelompok vitamin dijadikan satu wadah tersendiri, yaitu dalam labu ukur ukuran 100 ml, demikian juga dengan kelompok zat pengatur tumbuh ditempatkan pada satu wadah tertentu.
            Pembuatan media kultur dilakukan dengan jalan mengencerkan larutan stok nutrisi dan vitamin sesuai dengan ketentuan.  Setelah larutan stok dan vitamin tercampur rata maka dimasukkan ke dalam media kultur (sesuai perlakukan) zat pengatur tumbuh 2,4-D,BAP dan Kinetin (sesuai dengan perlakuan), 20 g/l media sukrosa, dan agar 7 g/l media;  subkultur kalus 5 kali pada media MS + 3,00 ppm 2,4-D (penelitian tahap I) sambil diaduk rata media tersebut, lalu dicukupkan volumenya menjadi satu liter, dengan menambahkan aquades steril.  Selanjutnya ditetapkan pH-nya menjadi 5,8 dengan jalan menambahkan beberapa tetes larutan NaOH ataupun KCl.
            Selanjutnya masing-masing campuran media kultur tersebut dipanaskan dengan pemanas elektrik sambil diaduk terus, menjelang mencapai titik didihdimasukan agar 7 g/l media.  Setelah setiap campuran larutan media kultur menjadi jernih, masukkan 2.0 g/l media arang aktif, selanjutnya setelah 2 menit pemanasan dihentikan dan segera dimasukkan larutan media tersebut ke dalam botol kultur sebanyak 10 ml per botol kultur dan mulut botol ditutup dengan aluminum foil.  Selanjutnya botol kultur yang berisi media disterilkan dengan autoklave selama 30 menit pada tekanan 15 Psi dengan suhu 121oC.
            Setelah disterilkan botol yang berisi media kultur tersebut dikeluarkan dari dalam autoklave, kemudian digoyang sedikit, supaya media dalam botol merata, selanjutnya diinkubasi selama 1 minggu diruang transfer sebelum digunakan untuk penanaman bahan tanam kultur.
            Larutan stok masing media perlakukan MS yang telah tersedia dilakukan pemipetan media dan dilakukan penambahan zat pengatur tumbuh.  Kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh yang diperlakukan pada media kultur adalah : A) 1,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10  pprn Kinetin;  B). 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn. Kinetin; C). 3,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0, 10 pprn Kinetin; D).1,00 ppm 2,4-D + 3,5  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; E). 2,00 ppm 2,4-D + 3,50  ppm BAP + 0, 10 ppm Kinetin; F). 3,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm. BAP + 0, 10 ppm Kinetin, kemudian  dilakukan sterilisasi media dan diinkubsi selama 1 minggu.
Sumber bahan eksplan yang berasal dari tunas sukun dilakukan seleksi terlebih dahulu, tunas yang lolos seleksi disterilisasikan dengan jalan perendaman  secara berturut-turut kedalam larutan : Tween 20 0.05 % (selama 2 menit), Benlate 0.01 g +Streptomycin 0.05 g (15 menit), asam askorbit 0.50 g (30 menit), Na-Hypoklorit 20 % (2 menit), alkohol 70 % (beberapa detik), dan dibilas satu kali dengan aquades steril (Satria,2005).  Tunas yang telah disterilkan dikulturkan pada media berbagai media kultur MS yang diperkaya dengan kombinasi konsentrasi 2,4-D,BAP, dan Kinetin (sesuai perlakukan) sukrosa 20 g/l media, dan 7 g/l media agar. Seleksi dan pengamatan keragaman somaklonalnya dilakukan dengan jalan pengamatan penampilan morfologis seperti bentuk kalus,daun, perakaran, dan pertumbuhan bibit mutan.
Eskplan tunas sukun yang membentuk kalus dilakukan setelah 3 bulan  disubkultur 4 kali pada media MS yang diperkaya dengan 3,00 ppm 2,4-D, dengan frekwensi sub kultur 3 minggu sekali. Selanjutnya kalus yang telah disubkultur 3 kali selama  12 minggu, dilihat keragaman somaklonal melalui pengamatan penampilan morfologis dan seleksikarakter genetik yang muncul.
Setiap media kultur yang telah dibuat sebelum digunakan ditempatkan  diruang inkubasi dengan suhu 20 oC, kelembaban 85 % dan intensitas cahaya 85 -90 % yang diatur, demikian pula dengan eskplan yang telah dikulturkan.  Ruang tranfer/ruang tanam dan ruang inkubasi sebelum digunakan disterilkan lebih dulu dengan alkohol.
Pengamatan pada percobaan I   terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang dikulturkan  dilakukan satu minggu setelah pengkulturan eskplan, selanjutnya pengamatan dilakukan setiap hari sekali,dan pengamatan ini berlangsung selama 3 bulan.  Peubah yang diamati meliputi : Persentase eksplan hidup; Jumlah, struktur dan warna kalus yang terbentuk; Diameter kalus yang terbentuk; Bobot segar kalus; Persentase eksplan membentuk shootlet; Jumlah shootlet yang terbentuk;  Persentase eksplan membentuk plantlet dan Jumlah plantlet yang terbentuk
Pengamatan pada percobaan sub kultur kalus yang dikulturkan dilakukan satu minggu setelah sub kultur , selanjutnya pengamatan dilakukan setiap hari sekali,dan pengamatan ini berlangsung selama 3 bulan. Pengamatan ini  dilakukan untuk melihat sejauhmana terjadinya keragaman somaklonal. Peubah yang diamati meliputi :  Persentase kalus bertahan hidup;  Jumlah, struktur dan warna kalus yang mengalami keragaman somaklonal;. Diameter kalus yang mengalami keragaman somaklonal; Bobot segar kalus yang mengalami keragaman somaklonal; Persentase kalus membentuk shootlet; Jumlah shootlet yang terbentuk; Persentase kalus membentuk plantlet yang mengalami keragaman somaklonal;  Jumlah plantlet yang terbentuk; Bentuk daun dan warna daun plantlet yang mengalami keragaman   somaklonal dan  Kondisi akar plantlet

II. Percobaan tahap kedua
            Kalus,tunas, dan plantlet yang terbentuk pada penelitian tahap I, diiiradiasi   dengan sinar gamma, sesuai dengan dosis perlakuan masing-masing.   Selanjutnya  bahan tanam (kalus,tunas, dan plantlet) sukun yang telah diiradiasi dengan sinar gamma sesuai dengan perlakuaan dilakukan sub kultur pada media WPM tanpa ZPT selama 1 minggu (media tersebut telah dipersiapkan sebelumnya sama seperti persaipan media untuk kultur eksplan pada penelitian tahap pertama). Selanjutnya kalus mutan sukun  diregenerasikan pada media WPM yang diperkaya dengan 0,50 NAA, 0,10 ppm Kinetin dan  3,50 ppm, sukrosa 20 g/l media dan agar 7 g/l  selama 3 minggu,dan tunas mutan sukun diregenerasikan pada media WPM yang diperkaya dengan 3,00 ppm NAA+ 1,75 ppm BAP selama 3 minggu,sukrosa 20 g/l media dan agar 7 g/l dan   kemudian ditempatkan diruang inkubasi pada suhu 20-25oC, pada kelembaban 80-90% dan intensitas cahaya 80-85%.  Untuk tunas dan plantlet mutan juga  disub kultur dimedia sub kultur (media WPM tanpa ZPT) bukan pada media regenerasi kalus.
Setiap media kultur yang telah dibuat sebelum digunakan ditempatkan  diruang inkubasi dengan suhu 20 oC, kelembaban 85 % dan intensitas cahaya 85 -90 % yang diatur, demikian pula dengan kalus, tunas dan plantlet hasil perlakuan iiradiasi sinar gamma setelah di sub kultur di inkubasikan dalam ruang steril..  Ruang tranfer/ruang tanam dan ruang inkubasi sebelum digunakan disterilkan lebih dulu dengan alkohol.
Pengamatan pada percobaan tahap II ,yaitu percobaan irradiasi sinar gamma dimulai  2 minggu setelah bahan tanam (kalus,tunas,plantlet) diiradiasi.  Selanjutnya seleksi dan pengamatan dilakukan setiap hari sekali, dan percobaan berlangsung selama 4 bulan. Peubah yang diamati meliputi : Persentase  hidup mutan yang mengalami mutasi; LD 50 = E$D 50;  Jumlah mutan kalus bertahan hidup yang mengalami mutasi;Persentase mutan shootlet bertahan hidup setelah mengalami mutasi; Persentase mutan plantlet yang bertahan hidup setelah mengalami mutasi; Penampilan kalus,shootlet dan plantlet yang mengalami mutasi;  Panjang daun mutan bibit yang mengalami mutasi; Lebar daun mutan bibit yang mengalami mutasi; Panjang akar mutan plantlet yang mengalami mutasi; Panjang akar mutan bibit yang mengalami mutasi dibandingkan dengan panjang akar bibit (kontrol)

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Percobaan Tahap  Pertama


1.  Persentase eksplan yang hidup

Hasil sidik ragam terhadap persentase eksplan hidup selama 12 minggu akibat perlakuan berbagai perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D (Auksin), BAP dan Kinetin (Sitokinin) pada media kultur MS setelah dianalisis secara statistik,  menunjukkan  pengaruh berbeda nyata setelah dilanjutkan dengan uji  DMNRT pada taraf 5 % yang disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Persentase eksplan yang hidup  umur 12 minggu  setelah pengkulturan (Msp) pada  beberapa kombinasi konsentrasi 2,4-D,  BAP, Kinetin (%)

  Kombinasi Konsentrasi 
          2,4-D + BAP+Kinetin
        
                      Rerata
  
   1,00 ppm + 1,75 ppm+0,10 ppm (K1)
   2,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K2)
   3,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K3)
   1,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K4)
   2,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K5)
   3,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K6)
      55,00 c
      95,00 a
      78,00 b
      75,00 b
      72,00 b
      70,00 b
              KK = 15,67%

Angka-angka pada lajur yang sama diikuti oleh kecil yang sama adalah berbeda tidak nyata menurut DMNRT pada taraf  nyata 5 %


Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa kombinasi konsentrasi 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin (  (K4)  memberikan pengaruh yang berbeda nyata  dibandingkan dengan perlakukan lainn dalam hal persentase eksplan yang hidup.
Hal ini  disebabkan karena  berbagai kombinasi konsentrasi Auksin dan Sitokinin mampu mendorong pertumbuhan dan perkembangan eksplan sehingga eksplan mempunyai kemampuan untuk dapat dapat hidup.
Moore (1979) ; George dan Sherrington (1984) melaporkan bahwa pemberian zat pengatur tumbuh Auksin dan Sitokinin pada konsentrasi rendah mampu merangsang pertumbuhan dan perkembangan eksplan  serta mempertahankan daya hidup jaringan eksplan, tetapi pada konsentrasi yang tinggi zat pengatur tumbuh dapat bersifat menghambat perkembangan morfogenesisi eksplan.
Perimbangan konsentrasi zat pengatur tumbuh Auksin dan Sitokinin dalam jaringan eksplan dapat meningkatkan kemapuan hidup, pertumbuhan dan perkembangan jaringan eksplan (Satria, Dwipa, dan Jamsari, 1999)


2.  Persentase eksplan yang mengalami pencoklatan

Hasil sidik ragam terhadap persentase eksplan mengalami pencoklatan selama 12 minggu akibat perlakuan berbagai perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D (Auksin), BAP dan Kinetin (Sitokinin) pada media kultur MS setelah dianalisis secara statistik,  menunjukkan  pengaruh berbeda          nyata setelah dilanjutkan dengan uji  DMNRT pada taraf 5 % yang disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2.Persentase eksplan mengalami pencoklatan  umur 12 minggu  setelah pengkulturan (Msp) pada  beberapa kombinasi konsentrasi 2,4-D,  BAP, Kinetin(%)

  Kombinasi Konsentrasi 
          2,4-D + BAP+Kinetin
        
                      Rerata
  
   1,00 ppm + 1,75 ppm+0,10 ppm (K1)
   2,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K2)
   3,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K3)
   1,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K4)
   2,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K5)
   3,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K6)
      26,00 c
      5,00 a
      15,00 b
      20,00 b
      22,00 bc
      25,0 c
              KK = 20,2%

Angka-angka pada lajur yang sama diikuti oleh kecil yang sama adalah berbeda tidak nyata menurut DMNRT pada taraf  nyata 5 %


Dari Tabel 2 dapat dilihat bahwa kombinasi konsentrasi 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin (  (K4)  memberikan pengaruh yang berbeda nyata  dibandingkan dengan perlakukan lain dalam hal persentase eksplan yang yang mengalami pencoklatan yang terendah.
Hal ini diduga bahwa eksplan yang ditanam pada media kultur  yang ditambahkan zat pengatur tumbuh pada kombinasi konsentrasi 2,00 ppm 2,4-D+ 3,50 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin  tersebut telah mampu untuk mengatasi senyawa fenol yang dihasilkan oleh eskplan.  Hal  ini sesuai dengan yang dikatakan oleh George and Sherrington (1984) ; Zaid (1995) ; dan Satria (1995) bahwa kombinasi konsentrasi auksin  (2,4-D)  dan Sitokinin (BAP) yang tinggi dapat menunda sintesa senyawa polyfenol dan mengurangi pencoklatan pada eksplan.

2.  Persentase eksplan membentuk kalus

Hasil sidik ragam terhadap persentase eksplan membentuk kalus selama 12 minggu akibat perlakuan berbagai perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D (Auksin), BAP dan Kinetin (Sitokinin) pada media kultur MS setelah dianalisis secara statistik,  menunjukkan  pengaruh berbeda nyata setelah dilanjutkan dengan uji  DMNRT pada taraf 5 % yang disajikan pada Tabel 3.
Dari Tabel 3 dapat dilihat bahwa kombinasi konsentrasi 2,00 ppm 2,4-D + 1,75 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin (  (K4)  memberikan pengaruh yang berbeda nyata  dibandingkan dengan perlakukan lain dalam hal persentase eksplan membentuk kalus,dan sekaligus menunjukkan persentase eksplan membentuk kalus tertinggi.
Hal ini disebabkan karena zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam kondisi seimbang dalam menunjang pembentukkan kalus.
Widiastoety (1985) melaporkan bahwa pembentukkan kalus terjadi jika perbandingkan Auksin dan Sitokinin dalam keadaan yang seimbang.


Tabel 3.Persentase eksplan membentuk kalus  umur 12 minggu  setelah pengkulturan (Msp) pada  beberapa kombinasi konsentrasi 2,4-D,  BAP, Kinetin (%)

  Kombinasi Konsentrasi 
          2,4-D + BAP+Kinetin
        
                      Rerata
  
   1,00 ppm + 1,75 ppm+0,10 ppm (K1)
   2,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K2)
   3,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K3)
   1,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K4)
   2,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K5)
   3,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K6)
      40,00 c
      70,00 a
      50,00 b
      35,00 c
      35,00 cd
      25,00 d
              KK = 28,5%

Angka-angka pada lajur yang sama diikuti oleh kecil yang sama adalah berbeda tidak nyata menurut DMNRT pada taraf  nyata 5 %


Selanjutnya perbedaan  bagian bahan eksplan akan mempengaruhi kemampuan eksplan membentuk kalus, sebagaimana pendapat Wiendi,Wattimena, dan Gunawan (1991) bahwa kemampuan eksplan membentuk kalus dan laju pertumbuhannya dapat berbeda antar bagian jaringan eskplan.  Hal ini sesuai dengan hasil percobaan Masyudi (1993) yang mana terdapat perbedaan kemampuan eksplan membentuk kalus dan daya regenerasi kalus antara bagian-bagian dari jaringan eksplan.  
Disamping itu menurut Mandang (2000) bahwa media MS merupakan jenis media yang paling  banyak dipakai dalam kultur jaringan dimana keistimewaan dari media MS adalah kandungan nitrat, kalium dan ammonium yang tinggi(Kyte, 1990).
Empat factor yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam kultur jaringan yaitu genotype, media,lingkungan tumbuh dan fisiologi jaringan tanaman sebagai eskplan (Wattimena, et al, 1991).
Pada dasarnya  setiap tanaman dapat digunakan sebagai sumber eksplan, tetapi sel-sel yang telah mengalami differensiasi lebih sukar ditumbuhkan dibandingkan dengan sel meristematik.Scheiden dan Schwan mengatakan bahwa sel  mempunyai kemapuan otonom dan totipotensi.  Totipotensi adalah kemampuan setiap sel darimana saja sel itu diambil, bila ditempatkan dalam lingkungan yang sesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Selanjutnya Rendahnya persentase terbentuknya kalus disebabkan terganggunya keseimbangan hormone endogen  atas batas optimum, sehingga proses proliferasi sel akhirnya menjadi terganggu dan akibatnya jumlah eksplan yang membentuk kalus menjadi menurun.   Secara umum persentase terbentuknya kalus yang rendah juga disebabkan besarnya pengaruh fenol yang dikeluarkan oleh semua jenis eksplan.

4. Struktur kalus dan  Warna Kalus
Pengamatan struktur kalus dan warna kalus dilakukan secara visual dan menggunakan pinset. Struktur kalus yang dihasilkan pada berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D (Auksin), BAP dan Kinetin (Sitokinin) pada media kultur MS) ditampilkan pada Tabel   4.
Dari Tabel 4 dapat dilihat bahwa respon berbagai jenis eksplan yang dikulturkan pada  berbagai  media kultur  memperlihatkan  perbedaan terhadap  struktur kalus  dan warna kalus tanaman penghasil gaharu.  Umumnya struktur kalus yang terbentuk pada percobaan ini  berbentuk kompak dan mempunyai warna yang berbeda. 
Berdasarkan hasil yang beranekaragam tersebut  struktur kalus yang diperoleh pada percobaan ini data dipengaruhi oleh genotip eksplan yang digunakan serta  media kultur yang digunakan.   Wattimena et al(1992) menyatakan bahwapembentukan kalus atau organ pada  kultur in vitro lebih dipengaruhi oleh genotype, inisiasi kultur,lingkungan tumbuh dan fisiologi jaringan yang digunakan.  Bentuk, tekstur, warna dan kemampuan morfogenetik serta diferensiasi sel tergantung pada umur dan kemurnian jaringan yang digunakan sebagai eksplan.  Perbedaan yang terjadi akan lebih besar jika eksplan tersusun lebih dari satu jenis sel(George dan Sherrington, 1984).

Tabel 4. Struktur dan warna kalus  umur 12 minggu  setelah pengkulturan (Msp) pada  beberapa kombinasi konsentrasi 2,4-D,  BAP, Kinetin

Kombinasi Konsentrasi
2,4-D+ BAP+Kinetin
        
   Struktur Kalus
Warna Kalus
1,00 ppm + 1,75 ppm +  0,10 ppm (K1)

  2,00 ppm + 1,75 ppm +  0,10 ppm(K2)
  
   3,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K3)

   1,00 ppm + 3,50 ppm +  0,10 ppm(K4)
  
   2,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K5)

   3,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K6)
remah dan kompak


remah


remah dan kompak


remah


remah dan kompak


remah dan kompak

Putih kekuningan


Putih kekuningan


Putih kecoklatan


       Putih kehijauan


       Putih kehijauan


        Putih kehijauan
   

Kalus dari berbagai spesies dapat berbeda tekstur, viabilitas dan warna dan pembentukan kalus ditandai dengan perubahan tekstur eksplan menjadi kasar dan permukaannya mengkilat saat terpantul cahaya (Wetherell, 1982).  Berdasarkan hasil percobaan di atas menunjukkan bahwa umumnya struktur kalus tersebut kompak maka jenis kalus ini cocok dimanfaatkan untuk organogenesis.  Triatminingsih , Karsinah dan Wahyuni (2000) menyatakan bahwa bentuk dan warna kalus akan menentukanarah morfogenesis selanjutnya.  Kalus yang remah cocok dimanfaatkan untuk embriogenesis sedangkan kalus  yang kompak untuk organogenesis.
Struktur kalus kompak yang diperoleh pada penelitian ini mengambarkan bahwa peluang kalus untuk  dikembangkan dan ditumbuhkan lebih lanjut menjadi tanaman untuh(plantlet) secara langsung lebih besar.  Hal ini dapat menjadi suatu nilai tambah bagi pemuliaan tanaman dalam rangka upaya mengatasi kelangkaan tanaman penghasil gaharu secara in vitro.

5.  Persentase eksplan membentuk shootlet 
Hasil sidik ragam terhadap persentase eksplan membentuk shootlet selama 12 minggu akibat perlakuan berbagai perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D (Auksin), BAP dan Kinetin (Sitokinin) pada media kultur MS setelah dianalisis secara statistik,  menunjukkan  pengaruh berbeda nyata setelah dilanjutkan dengan uji  DMNRT  pada taraf 5 % yang disajikan pada Tabel 5.

Tabel 5. Persentase eksplan membentuk shootlet  umur 12 minggu  setelah pengkulturan (Msp) pada  beberapa kombinasi konsentrasi 2,4-D,  BAP, Kinetin (%)

  Kombinasi Konsentrasi 
          2,4-D + BAP+Kinetin
        
                      Rerata
  
   1,00 ppm + 1,75 ppm+0,10 ppm (K1)
   2,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K2)
   3,00 ppm + 1,75 ppm + 0,10 ppm(K3)
   1,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K4)
   2,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K5)
   3,00 ppm + 3,50 ppm + 0,10 ppm(K6)
      12,00 c
      10,00 c
      10,00 c
      45,00 a
      25,00 b
      20,00 b
              KK = 17,6%

Angka-angka pada lajur yang sama diikuti oleh kecil yang sama adalah berbeda tidak nyata menurut DMNRT pada taraf  nyata 5 %

Tabel 5 memperlihatkan bahwa persentase eksplan  membentuk shootlet  yang terbentuk tertinggi, yaitu 45,00%  dijumpai pada eksplan kalus yang disubkulturkan  pada media MS yang diperkaya dengan kombinasi konsentrasi 1,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin berbeda nyata dengan perlakuan lainnya.
Pemberian kombinasi konsentrasi 1,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin dalam keadaan seimbang mendorong pertumbuhan eksplan dan perkembangan eksplan membentuk shootlet yang lebih tinggi.  Perbanyakan dengan menggunakan kalus diharapkan terjadinya organogenesis yang meruapakan salah sumber keragaman genetic dengan terjadinya kemungkinan variasi somaklonal (Wattimena et al., 1991).
Wattimena (1988) dan Satria (1999) mengatakan bahwa kalus dapat beregenrasi membentuk shootlet apabila terjadi keseimbangan antara zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Agusta, (1995) melaporkan bahwa sitokinin berfungsi dalam merangsang pembentukan tunas, berpengaruh terhadap metabolisme sel dan merangsang  sel .
                    Selanjutnya Wiendi , Wattimena, dan Winata (1991); dan Wattimena 1988 melaporkan bahwa Pertumbuhan dan morfogenesis tanaman membentuk shootlet dan plantlet  secara in vitro dikendalikan oleh keseimbangan dari zat pengatur tumbuh Auksin dan Sitokinin dalam jaringan eksplan.
Jika pemberian zat pengatur tumbuh melebihi konsentrasi optimum, dapat menyebabkan jumlah shootlet yang terbentuk sedikit.  Hal ini didukung oleh pernyataan Tiwari et al., (2000) bahwa konsentrasi sitokinin yang tinggi menyebabkan jumlah shootlet yang terbentuk sedikit, dan BAP melebih kadar optimum yang dibutuhkan tanaman umumnya menyebabkan perkembangan tajuk atau shootlet terhambat, dan Satria et al (2005) menyatakan bahwa konsentrasi BAP yang tinggi  dapat menyebabkan panjang shootlet terhambat.  Damayanti  (2004) juga menyatakan bahwa BAP tidak memperpanjang shootlet tanaman Dianthus caryophillus, bahkan sebaliknya menyebabkan shootlet terlihat lebih pendek dan kerdil.
Agusta, (1995) melaporkan bahwa sitokinin tinggi  berfungsi dalam merangsang pembentukan tunas, berpengaruh terhadap metabolisme sel dan merangsang  sel .


6.  Struktur kalus dan warna kalus  seetelah disubkultur

Hasil pengamatan terhadap struktur kalus dan warna kalus umur 12 minggu setelah disubkultur 5 kali pada media MS yang diperkaya dengan konsentrasi 3,00 ppm 2,4-D dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Struktur dan warna kalus  umur 12 minggu  setelah subkultur  lima kali pada konsentrasi  3,00 ppm 2,4-D

Perlakuan
Struktur Kalus sebelum subkultur
Warna Kalus sebelum subkultur
Struktur Kalus setelah subkultur
Warna Kalus setelah
subkultur
K1


K2


       K3


K4



       K5


        K6
remah dan kompak

remah


remah dan kompak

remah



remah dan kompak

remah dan kompak

Putih kekuningan

Putih kekuningan

Putih kecoklatan

Putih kehijauan


Putih kehijauan

Putih kehijauan

remah dan bintik 

remah dan bintik

remah dan kompak

remah, bintik,pecah


remah dan kompak

remah dan kompak
Putih
kehitaman

Putih
agak hitam

Putih kecoklatan

Belang (putih,kuning, hijau

Putih kekuningan

Putih kekuningan

Berdasarkan hasil yang beranekaragam tersebut  struktur kalus yang diperoleh pada percobaan ini data dipengaruhi oleh subkultur bebepa kali pada media MS yang diperkaya dengan konsentrasi 3,00 ppm 2,4-D, sehingga terjadinya perubahan struktur kalus dan warna kalus. Perubahan struktur kalus dan warna kalus terjadi karena adanya terjadi perubahan kromosom atau gen sehingga meningkatkan keragaman somaklonal kalus.  Hal ini dapat dibuktikan dengan perubahan struktur dan warna kalus sebelum dan setelah subkultur. Struktur kalus remah dengan warna kalus putih kehijauan yang terbentuk sebelum subkultur akibat perlakuan kombinasi konsentrasi 2,00ppm 2,4 D + 1,75ppm BAP + 0,10 ppm Kinetin (K4) dan setelah subkultur 5 kali pada 3,00 ppm 2,4-D mengalami perubahan dimana struktur kalus remah dan berbintik dan warna menjadi belang-belang(putih, kuning dan kehijauan).

3.2.  Percobaan Tahap II
Berdasarkan hasil pengamatan terhadap percobaan tahap 1 sampai subkultur kalus 5 kali pada media MS yang diperkaya dengan 3, 00 ppm  2,4-D, materi kalus dan shootlet siap untuk dilanjutkan untuk percobaan tahap kedua, yaitu tahap peningkatan kergaman somaklonal melalui irradiasi sinar gamma, tetapi  sebelum materi gentik tersebut dibawa ke BATAN Pasar Jum’at terjadi bencana Gempa Bumi di Sumatera Barat, sehingga seluruh mater genetik yang ada dalam botol kultur yang berisi kalus dan shootlet pecah dan  berantakan dan seluruh kalus dan shootlet, jaringannya mengalami kekeringan dan mati sehingga tak dapat digunakan untuk pengamatan.
Selanjutnya peneliti  telah mencoba mengulang kembali penelitian dari awal tetapi hasilnya hanya sampai pada  percobaan tahap1, sehingga penelitian tetap dilanjutkan tetapi karena laporan harus diselesaikan akhir November maka pada kesempatan ini kami melaporkan sampai penelitian tahap pertama.










4. Kesimpulan dan Saran


4.1.  Kesimpulan
Berdasarakan hasil penelitian  mengenai peningkaatan keragaman somaklonal melalui kultur in vitro dan irradiasi sinar gamma maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1.  Kombinasi konsentrasi 2,00  ppm  2,4-D +  1,75 ppm BAP + 0,10 ppm  Kinetin pada media MS menunjukkan hasil yang tertinggi dalam mendorong    eksplan yang hidup, mengalami pencoklatan yang terendah, saat terbentuk kalus tercepat, persentase eksplan membentuk kalus tertinggi,  terjadinya peningkatan keragaman somaklonal kalus
2. Kombinasi konsentrasi 1,00 ppm 2,4-D + 3,50 ppm Bap + 0,10 ppm Kinetin pada Media MS menunjukkan persentase eksplan membentuk shootlet tertinggi. 
3.  hasil percobaan tersebut sebelum diperlakukan pada percobaan tahap dua yaitu tahap peningkatan keragaman somaklonal hasil in vitro dengan irradiasi sinar gamma, terjadi bencana gempa bumi sehingga seluruh materi percobaan hasil penelitian tahap 1 tidak dapat digunakan karena seluruh jaringan eksplan mengalami kematian dan  peneliti tetap akan menyelesaikan penelitian tahap kedua nantinya dan

4.2.  Saran
 Perlu penelitian lebih lanjut guna meningkatkan keragaman somaklonal melalui kultur in vitro dengan peningkatan subkultur dari 5 kali menjadi 7 kali pada konsentrasi 3,00 ppm 2,4-D





   Ucapan  Terima Kasih
Terima kasih peneliti  ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional Jakarta yang telah mendanai penelitian ini melalui Dana Penelitian Fundamental Tahun 2009 , mudah-mudahan hasil penelitian ini bermanfaat bagi  semua pihak.dengan nomor kontrak; 1260/H.16/PL/HB.PSN/IV/2009, tanggal 16 April 2009.  Mudah-mudahan hasil penelitian ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pertanian.


Daftar Pustaka
Ardi, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1993 .  Uji toleran kedelai M1 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.

____, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1994 .  Uji toleran kedelai M2 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.

____, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1995 .  Uji toleran kedelai M3 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.
 ____, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1996 .  Uji toleran kedelai M4 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.

____, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1997 .  Uji toleran kedelai M5 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.

____, Jamsari, Satria B dan Latifah.   1998 .  Uji toleran kedelai M6 pada  lahan  
           masam. Fakultas Pertanian  Unand. Laporan penelitian kerjasama Faperta 
           Unad dengan Bappeda Sumbar.

Bringgs,  R.W. and M.J.  Constantin. 1977. Radiation type and radiation sources. In : Manual on Mutation Breeding, Technical Report Series. No. 119, IAEA Viena.  P. : 7-21

Broertjes, C. And A.  M. Van Harten. 1987. Application of mutation breedinga method. In : A. J. Abbot and R. K. Atkin (Eds.). Improving Vegetatively Propagated Crops. Academy Press, Harcourt Brace Javanovice Publisher. London.  P. : 337-347.

Crowder,  L.V. 1990.  Genetika Tumbuhan. Gajah Mada Universitas Press. Diterjemahkan oleh Kusdiarti L. 499 hal.

Darajat A.A.  1987.  Variabilitas dan Adaptasi Genotipe Terigu pada berbagai Lingkungan Tumbuh di Indonesia.  Disertsi.  Universitas Padjadjaran Bandung. Tidak dipublikasikan.

Evans, D.A.,  W.R.  Sharp, and E.E.  Flick.  1980.  Plant regeneration from cell cultur. In : D.A Evans, W.R. Sharp, and P.  Amirato (Eds).  Handbook of Plant Cell Culture vol 4. Techniques and application. Mc Millan Publ.  New York.

Fauza H.   2003.    Variabilitas penampilan fenotipik dan genetik manggis hasil irradiasi sinar gamma memlaui analisis RAPD.  Tesis S2 (tidak dipublikasikan).  Program Pasacasarjana Universitas Padjajaran Bandung.  98 hal.

Fehr, W.R.  1987.  Principles of Cultivar Development, Theory and Technique. McGraw Hill, Inc.  New York. 536 pp.
Furnier, G.R. and Z. Liu. 1993.  Comparison of alloenzyme, RFLP and RAPD markers for asesing genetic variation. Amer.J.Bot 80:46-47.

Gamborg, O.L and J.P‑Shyluk. 1981. Nutrion, media, and characteristics of plant cell and tissue culture. P. 21‑24. In T.A.. Thrope(ed). Plant Tissue Culture Methods Application in Agriculture. Academic Press Inc. New York.


Gaul, H. 1977. Mutagen effect ini the first generation after sed treatment. In : Manual on Mutation Breeding. Technical Report series IAEA. Vienna. 119:87-96.
George, E.F. and P.D. Sherrington. 1984. Plant propagation by tissue culture.Handbook and directory of comercial laboratory. Exegeticts. Ltd. England. 709 p.

Gill, K.S.  1989.  Germplasm collections and public plant breeder. In A.H.D. Brown (ed) .  The Use of Plant Genetik Resoursces.  Cambridge University Press.

Irawati, B. Satria, R. Mayerni.  2006.  Plestarian tanaman sukun melalui kultur in vitro.  Laporan Penelitian Dasar Dana Dikti.
 
Ismachin, M.  1994. Masalah dan prospek pemuliaan dengan teknik mutas. Prosiding Simposium Pemuliaan Tanaman II.  Perhimpunan Pemuliaan Tanaman Indonesia. Komisariat Jatim. Hal. 14-19.



Masnyah, E.  2002.  Analisis variabilitas genetik manggis melalui teknik RPAD dan fenotipiknya pada berbagai lingkungan tumbuhnya di Jawa dan Sumatera Barat. Tesis S2 (tidak dipublikasikan).  Program Pascasarjana Universitas Padjajaran Bandung.  1005 hal.

Moore, D.M. 1976. Plant cytogenetics. Chapman and Hall, London.

Murashige,T.C. 1974. Somatic plant cell. In Pul K.J.R. and MK Paterson, Jr (ed). Tissue Culture Methode an Aplication Academic Press. New York.           p: 170‑172.

Nassar, M.N.A., M.A. Vieira , and D. Grattapaglia.  1998.  A moleculer and embrionic studi of apomixis in cassava (Manihot esculenta Crantz) Euphytical.  102: 9-13.

Prommee, W. And Sompong, T. 1998. Effect of gamma irradiation on callus mutation of mangosteen (Garcinia mangostana). Abstract, Khon Kaen Agric 1998, 26(2) : 66-73. 00.

Prasetyorini. 1991.  Pengaruh Radiasi Sinar Gamma dan Jenis Eksplan terhadap Keragaman Somaklonal pada tanaman Gerbera (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook). Tesis. Fakultas Pascasarjana IPB Bogor.  91 hal.

Rohlf, F.J.  1993.  NT SYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 1.80. Exeter Software. New York.
_______
                .   2000.  NT SYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.1.  User Guide. Departemen of Ecology and Evolution state University of New York.

Ronning, C.M., R.J. Schnell, and D.N. Kuhn.  1995.  Inheritance of RAPD markers in theobroma cacao L.  J. Amer.Soc. Hort. Sci.  120: 681-686

Sastra,  D.R.,  1996.  Induksi Keragaman Somaklonal Kentang (Solanum tuberosum L.) dengan Radiasi Sinar Gamma. Tesis. Program Pascasarjana IPB Bogor 94 hal.

Satria, B. 1996. Perbanyakan manggis (Garcinia mangostana L.) dengan menggunakan eksplan hipokotil pada kombinasi dosis arang aktif dengan komposisi konsentrasi BAP dan NAA secara in‑vitro. Fakultas Pertanian Universitas Andalas Padang. 105 hal.

_____,1. Ferita, 1. Dwipa, dan Muhsanati. 1997. Komposisi media dan eksplafi untuk inisiasi dan proliferasi kalus manggis (Garcinia mangostana L.) secara in‑vitro. J. Stigma.. 5:1

_____, H. Fauza, dan Kasli. 1998. Induksi kalus manggis (Garcinia mangostana L.) secara kultur in‑vitro. J. Stigma.. 7(l):27‑31
_____,
           I. I. Dwipa dan Jasamari. 1999. Regenerasi kalus manggis (Garcinia mangostana L.) secara kultur in‑vitro. J. Stigma. 7(l):27‑3 1,


Steel, R.G.D. dan J.H.  Torrie. 1995. Prinsip dan Prosedur Staristika (terjemahan bambang Sumantri). PT Gramedia Jkarta. 748 hal.

Tatineni, V., R.Gcantrell, and D.D. Davis.  Genetic diversity in ellite cotton germplasm determined by morphological characters and RAPDs.  Crop Sci.  36 : 186-192. 

Wattimena.  1998. Bioteknologi tanaman. Faperta IPB Bogor.

Weeden,  N.F.,  G.M.  Timmerman, M,  Hemmat,  B.E. Kneen, and M.A. Lodhi. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers. In. Aplication of RAPD teccnology to plant breeding, Minnesota. 1 Nov. 1992. CSSA, Am, Soc. Horticul. Sci., and Am. Genet. Assoc. P. : 12-17.

Williams, J.K., A.R. kubelik., K.J. Livak, J.A. Rafalsky, and S,V. Tingey. 1990.  DNA polymorphisms amplified by arbitrari primers are useful as genetic maeker. Nucleid Acid Research. 18(22) : 6531-6535.


Mengetahui :                                                                Padang, 16  November  2009
Ketua Lembaga Penelitian                                           Ketua  Tim Peneliti,
 Universitas Andalas Padang,





 Dr. Ir. Syafrimen Yasin, MS, MSc                          Dra. Netti Herawati, MSc
NP. 131 647 299                                                          NP. 131 601 553


Komentar